投影式光固化3D打印高仿生支架负载工程化纳米囊泡促进大段骨再生
来源: EFL生物3D打印与生物制造 创伤、感染和骨肿瘤切除引起的大段骨缺损再生能力有限,与之相关的功能丧失严重影响患者的生活质量,因此对大段骨缺损的修复有着广泛的需求。目前,用于大段骨修复的原位仿生支架植入在再生医学领域获得了极大的普及。然而,由于缺乏合适的早期微环境调节能力,利用原位骨仿生支架修复大型节段性骨缺损尚未取得重大临床突破。 来自华中科技大学的孙家明团队在骨的天然微通道和皮质网络的启发下,利用投影式光固化3D打印技术(EFL-BP8601 Pro)制作了高仿生结构的PCLMA骨支架,该支架具有外层骨皮质、内层复杂网状的松质骨、Haversian管和横向穿透的Volkmann管。随后通过生物素-链霉亲和素系统将脂肪干细胞来源工程化纳米囊泡(ADSC-ENs)稳定地负载到支架表面。该支架为骨缺损区提供了具有合适活性成分的仿生结构支撑,人工构建了缺损区的局部血管化和成骨微环境。实验结果表明,该支架具有良好的生物相容性,能显著促进血管生成和成骨过程。相关工作以题为“Synergistic large segmental bone repair by 3D printed bionic scaffolds and engineered ADSC nanovesicles: Towards an optimized regenerative microenvironment”的文章发表在2024年4月8日的国际知名期刊《Biomaterials》。 1. 创新型研究内容 【工程化纳米囊泡的表征与生物素化】 为了获得高产量的工程化纳米囊泡(ENs),作者团队采用机械挤压的方法,分别使用10μm、5μm和1μm孔径的膜连续挤压ADSCs。扫描电子显微镜(SEM)显示ENs的形态为椭圆形(图1A)。纳米颗粒跟踪分析(NTA)进一步证明,ENs的尺寸在50-150 nm之间,最大峰位于62±1.5 nm,颗粒数量占总颗粒的86.35%(n=3)(图1B)。蛋白质定量显示,1×107ADSC获得的ENs蛋白质浓度可达88.35±6.62μg/mL,而同等数量ADSC获得的细胞外囊泡(EVs)的蛋白质浓度仅为2.85±1.04μg/mL(n=3)(图1C)。对EVs、ENs和细胞的考马斯亮蓝分析表明,ENs和细胞的蛋白质浓度具有非常相似的SDS-PAGE图谱,而EVs的SDS-PAGE图谱则完全不同(图1E)。其次,将生物素功能化的1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolaminepoly(乙二醇基)(DSPE-聚乙二醇)(DSPE-聚乙二醇-生物素)用于机械挤出改性ENs。用FITC标记的链霉亲和素对ENs的修饰结果进行了评估,荧光显微镜图像显示生物素成功地修饰到ENs上(图1D)。 图1 工程化纳米囊泡的生表征与生物素化【PCLMA的表征及材料的表面生物素化】 首先,使用MAAh对三臂聚己内酯(PCL)进行改性为PCLMA,以满足PCL材料的光固化性能(图2A)。用PCLMA树脂进行光交联后的光学图像表明,MAAh改性的三臂PCL具有光固化能力,在405 nm紫外光照射20 S后达到稳定固化(图2B)。随后,利用投影式光固化3D打印技术对PCLMA的打印性能进行了研究,并设计了不同的结构进行打印精度测试。此外,还使用了微距镜头进行多角度摄影,以探索印刷细节。结果表明,PCLMA可以以高打印精度打印各种三维结构,红色箭头表示PCLMA可以打印高达100μm(图2C)。由于在合成PCLMA的过程中,过量的MAAH取代了几乎所有的末端羟基,仿生支架的表面首先用盐酸和高锰酸钾处理,暴露了表面的羟基,然后进一步对生物素进行修饰,以实现支架表面的生物素修饰。接下来,生物素在仿生支架的表面被修饰,以允许更好地负载ENS(图2D)。仿生骨支架设计有中央髓管、外周哈弗管和外侧Volkmann管,以探索其使用PCLMA材料打印的可行性(图2E)。随后,用生物素对仿生骨支架进行生物素修饰,以用于链霉亲和素的接枝。最后,在各个角度下观察了支架的细节,PCLMA支架和生物化支架都具有良好的仿生结构(图2F)。FT-IR分析表明,与PCLMA相比,经HCl/KMnO4处理后得到的PCLMA-OH在3300-3650 cm-1处有一个峰,表明表面羟基暴露。此外,生物素化的PCLMA(PCLMA-Bio)在1500-1580 cm-1处有一个微小的峰,与PCLMA-OH相比略有移动,从而证实了生物素通过EDC/DMAP化学偶联成功地接枝到支架表面。接下来,用FITC标记链霉亲和素,荧光显微镜显示PCLMA-Bio Avidin+与PCLMA相比具有更强的荧光信号,这同样表明PCLMA成功的生物素化(图2G)。 图2 PCLMA的表征及材料的表面生物素化【ENs在材料表面的稳定接枝】 为了验证支架在体外的接枝稳定性,在链霉亲和素存在的情况下,将生物素化的 ADSC-ENs 与生物素化的 PCLMA、PCLMA-OH 和纯 PCLMA 共同培养,然后用超声波清洗器进行超声处理,以测试其机械稳定性(图 3A)。荧光图像显示,随着超声处理时间的延长,ADSC-ENs 的保留率逐渐下降。超声处理 60 秒后,可在生物素化 PCLMA 上清晰地检测到红色荧光标记的 ADSC-EN;相比之下,PCLMA-OH 或 PCLMA …